В волне молекулярного биологического тестирования флуоресцентный количественный детектор PCR с его основными преимуществами высокой чувствительности, высокой специфичности и точной количественной оценки стал основным оборудованием в области научных экспериментов, клинической диагностики и мониторинга безопасности пищевых продуктов. От скрининга вирусных нуклеиновых кислот во время новой вспышки короны A до ранней диагностики генетических заболеваний и отслеживания вредителей и болезней сельскохозяйственных культур, он похож на « молекулярный детектор A - детектор», способный точно улавливать микроизменения молекул нуклеиновых кислот и обеспечивать надежную поддержку данных для различных задач обнаружения. В этой статье вы узнаете больше о принципе работы флуоресцентного количественного детектора PCR, основном составе, сценариях применения и тенденциях развития технологии.

　I. Основные принципы флуоресцентного количественного детектора PCR: прорыв от "качественного" к "количественному"

Чтобы понять логику работы флуоресцентного количественного детектора PCR, сначала необходимо рассмотреть основы традиционной технологии PCR. В основе технологии PCR (полимеразная цепная реакция) лежит экспоненциальное расширение фрагментов целевой нуклеиновой кислоты посредством процесса циклического процесса высокотемпературной дегенерации, низкотемпературного отжига и расширения средней температуры, что позволяет достичь большого количества микронуклеиновой кислоты. Тем не менее, традиционная технология PCR может проводить только конечное качественное тестирование продуктов амплификации и не может точно определить концентрацию первоначального шаблона.

Технология флуоресцентного количественного PCR (Real - time PCR) на основе традиционного PCR вводит модуль обнаружения флуоресцентных сигналов, который реализует « синхронизацию процесса усиления с обнаружением сигнала». Основной принцип заключается в том, чтобы добавить флуоресцентную группу в систему реакции PCR, которая генерирует соответствующие флуоресцентные сигналы по мере увеличения фрагментов нуклеиновой кислоты цели во время амплификации PCR. Количественный детектор флуоресценции PCR, отслеживая интенсивность флуоресцентного сигнала каждого цикла в режиме реального времени, рисует кривую интенсивности флуоресценции с количеством циклов. Когда интенсивность флуоресцентного сигнала достигает заданного порога, соответствующее число циклов называется значением Ct (порог цикла). Поскольку значение Ct отрицательно коррелирует с концентрацией нуклеиновой кислоты в исходном шаблоне - чем выше начальная концентрация шаблона, тем меньше циклов требуется для достижения порога, поэтому первоначальная концентрация нуклеиновой кислоты в образце может быть точно рассчитана путем преобразования стандартной кривой.

В соответствии с механизмом, генерируемым флуоресцентными сигналами, флуоресцентная количественная технология PCR в основном делится на две категории: один - метод красителей, такой как SYBR Green I, краситель может быть неспецифическим в сочетании с двухцепочечной ДНК, чем больше продуктов усиления, тем сильнее флуоресцентный сигнал; Другая категория - это метод зонда, такой как зонд TaqMan, который связывается только с особенностями целевой последовательности и высвобождает флуоресцентные сигналы только тогда, когда зонд разлагается полимеразой во время процесса амплификации, с более высокой специфичностью и подходит для одновременного обнаружения нескольких целей.

　　II. Основной состав флуоресцентного количественного детектора PCR: взаимодействие прецизионных компонентов

Флуоресцентный количественный детектор PCR представляет собой точное устройство, объединяющее оптические, термодинамические, электронные и программные алгоритмы, основные компоненты которого взаимодействуют друг с другом, чтобы обеспечить точность и стабильность обнаружения. В основном это следующие ключевые модули:

1. Модуль терморегулирования: "Тепловой дворецкий" с расширением PCR

Модуль терморегулирования является ядром для обеспечения бесперебойного хода реакции PCR и требует точной реализации управления циркуляционной температурой « дегенерации (около 95°C), отжига (около 55 - 65°C) и расширения (около 72°C) ». В настоящее время основной технологией управления температурой является полупроводниковый контроль температуры PAR, в сочетании с высокоточными датчиками температуры и алгоритмами, может обеспечить быстрое нагревание и охлаждение (скорость нагрева до 4 - 6°C / s), обеспечивая при этом однородность температуры между отверстиями (ошибка a 0,5 °C), чтобы избежать несогласованности в скорости усиления из - за разницы в температуре. Кроме того, некоторые устройства также имеют функцию градиентного управления температурой, вы можете одновременно установить несколько градиентов температуры отжига, чтобы облегчить пользователям быструю оптимизацию условий реакции.

2.Модуль оптического обнаружения: "Захватчик" флуоресцентных сигналов

Модуль оптического обнаружения отвечает за сбор флуоресцентных сигналов во время реакции PCR в режиме реального времени, и его производительность напрямую определяет чувствительность и специфичность обнаружения. Модуль состоит в основном из трех частей: источника возбуждающего света, фильтра и детектора. Источниками возбужденного света обычно являются гало - вольфрамовые лампы, светодиодные лампы или лазеры, из которых светодиодные лампы широко используются из - за длительного срока службы, низкого энергопотребления и хорошей стабильности; Фильтры делятся на возбуждающие и излучающие фильтры, которые используются для фильтрации возбужденного и излучающего света на определенной длине волны, чтобы убедиться, что только целевые флуоресцентные сигналы обнаруживаются, уменьшая фоновые помехи; Детекторы используются для преобразования флуоресцентных сигналов в электрические сигналы. Основными детекторами являются фотоэлектрические мультипликаторы (PMT) или устройства с зарядовой связью (CCD), в которых чувствительность PMT выше и подходит для обнаружения проб с низкой концентрацией, а CCD обеспечивает многоканальное одновременное обнаружение и повышает эффективность обнаружения.

3.Программное обеспечение и модуль обработки данных: "Аналитик" результатов тестирования

Модули программного обеспечения и обработки данных отвечают за управление работой оборудования, сбор флуоресцентных сигналов и анализ и обработку данных. С помощью программного обеспечения пользователь может установить параметры цикла PCR (количество циклов, температура и время каждого этапа), канал обнаружения флуоресценции, порог и другие параметры; Во время работы устройства программное обеспечение рисует кривую флуоресценции (кривую усиления) в режиме реального времени; По окончании реакции программное обеспечение автоматически вычисляет концентрацию нуклеиновой кислоты в образце на основе значений Ct и стандартных кривых и составляет отчет об обнаружении. Кроме того, высококачественное программное обеспечение также имеет такие функции, как экспорт данных, массовая обработка, анализ контроля качества и т. Д., Чтобы удовлетворить нормативные потребности научных исследований и клинических испытаний.

　III. Широкое применение флуоресцентных количественных детекторов PCR: проникающее многопрофильное « оборудование для обнаружения всей энергии»

Флуоресцентный количественный детектор PCR благодаря своим преимуществам точной количественной, высокой чувствительности и быстрого обнаружения, широко используется в клинической диагностике, научных экспериментах, безопасности пищевых продуктов, мониторинге окружающей среды и многих других областях, стал « полным A - энергетическим игроком » в области молекулярного тестирования.

1.Область клинической диагностики: "острый инструмент" скрининга и мониторинга заболеваний

В клинической диагностике флуоресцентный количественный тест PCR является основным оборудованием для тестирования нуклеиновых кислот и широко используется для диагностики и мониторинга вирусных инфекций, бактериальных инфекций, генетических заболеваний, опухолей и других заболеваний. Например, в диагностике вирусной инфекции можно быстро обнаружить концентрацию нуклеиновых кислот нового коронавируса А, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса гриппа и т. Д. Для достижения раннего скрининга и диагностики; В диагностике генетических заболеваний можно обнаружить генетические мутации, хромосомные аномалии и т. Д. Чтобы обеспечить основу для дородовой диагностики генетических заболеваний, таких как средиземноморская анемия и синдром Дауна; При диагностике опухолей уровни нуклеиновых кислот в маркерах опухоли, таких как мутация гена EGFR, могут быть обнаружены, поддерживая ранний скрининг опухоли, целевое терапевтическое руководство и предварительный мониторинг.

2.Область научных экспериментов: "Основополагающие инструменты" молекулярно - биологических исследований

В исследованиях молекулярной биологии флуоресцентный количественный детектор PCR является основным оборудованием, часто используемым для анализа экспрессии генов, обнаружения вариаций числа копий генов, генетической дифференциации, прослеживания патогенов и других исследований. Например, при анализе экспрессии генов различия в уровнях экспрессии могут быть сопоставлены путем обнаружения Ct - значений целевого гена в различных тканях или условиях обработки; При обнаружении вариаций числа копий генов можно определить, увеличилось или уменьшилось количество копий целевого гена по сравнению с значением Ct эндогенного гена; В ретроспективных исследованиях патогенов генотип и эволюционные отношения патогенов могут быть проанализированы путем обнаружения специфических фрагментов нуклеиновых кислот патогенов.

3.Сфера продовольственной безопасности: "линия обороны" для обеспечения продовольственной безопасности

В мониторинге безопасности пищевых продуктов флуоресцентный количественный тест PCR может использоваться для обнаружения патогенов в пищевых продуктах (таких как сальмонелла, кишечная палочка и т. Д.), генетически модифицированных компонентов, остатков ветеринарных препаратов и т. Д. Например, можно быстро обнаружить патогенные нуклеиновые кислоты в свежих и обработанных продуктах питания и своевременно обнаружить риски безопасности пищевых продуктов; Может обнаруживать генетически модифицированные фрагменты в сельскохозяйственных продуктах, таких как соя и кукуруза (например, ген Cry1Ac), для достижения точной идентификации генетически модифицированных продуктов питания; Можно обнаружить остаточные маркеры нуклеиновых кислот, такие как тощий мясной концентрат, антибиотики и т. Д. В мясе, чтобы обеспечить качество и безопасность пищевых продуктов.

4. Область экологического мониторинга: "Монитор" экологической среды

В экологическом мониторинге флуоресцентный количественный тест PCR может использоваться для обнаружения микроорганизмов (таких как цианобактерии, кишечная палочка, патогенные бактерии и т. Д.) в пробах окружающей среды, таких как вода, почва и воздух, гены, связанные с деградацией загрязнителей. Например, можно обнаружить синтетические гены цианотоксина в воде и предупредить о цветении цианобактерий; Может обнаруживать гены устойчивости к тяжелым металлам в почве и оценивать степень загрязнения почвы; Гены резистентных к лекарствам бактерий могут быть обнаружены в окружающей среде, отслеживать распространение устойчивых к лекарствам бактерий и обеспечивать поддержку данных для защиты окружающей среды и безопасности общественного здравоохранения.

　Тенденции развития флуоресцентных количественных детекторов PCR: более быстрые, точные и удобные

По мере того, как технология молекулярного обнаружения продолжает развиваться, флуоресцентный количественный детектор PCR также развивается в направлении более быстрого, точного, удобного и высокого потока для удовлетворения потребностей в тестировании в различных областях.

1. Ускорение: сокращение времени тестирования

Традиционные флуоресцентные количественные тесты PCR обычно занимают 1 - 2 часа, что затрудняет удовлетворение потребностей в экстренном тестировании. Таким образом, ускорение становится важной тенденцией развития. Оптимизируя технологию контроля температуры (например, использование лазерного нагрева, микроволнового нагрева и других новых методов нагрева), увеличивая скорость подъема и падения температуры (до 10 ° C / с и выше), время одного цикла может быть сокращено до нескольких десятков секунд, весь процесс обнаружения может быть сжат до 30 минут или даже около 15 минут, подходит для профилактики и борьбы с эпидемией, чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения и других сценариев обнаружения в чрезвычайных ситуациях.

2. Qualcomm Qualcomm Qualcomm Qualcomm Qualcomm: повышение эффективности тестирования

Для удовлетворения потребностей крупномасштабного тестирования образцов Qualcomm количественная оценка стала основным направлением развития. В настоящее время канал обнаружения основного оборудования был увеличен с 96 до 384 отверстий или даже 1536 отверстий, что позволяет одновременно обнаруживать большое количество образцов, что значительно повышает эффективность обнаружения. Кроме того, применение многоканальной технологии обнаружения (например, 6 каналов, 8 каналов) может обеспечить одновременное обнаружение нескольких целей в одном образце, уменьшить количество образцов и время обнаружения, подходит для совместного скрининга нескольких патогенов, дифференциации генов и других сценариев.

Миниатюризация и переносимость: расширение сценариев применения

Традиционный флуоресцентный количественный детектор PCR большой размер, зависит от лабораторной среды, трудно удовлетворить потребности полевых испытаний. Поэтому миниатюризация и портативность стали важными направлениями развития. Благодаря интеграции технологии микроконтроля потока, микрооптического модуля, встроенной системы и т. Д. Разработан портативный флуоресцентный количественный детектор PCR, небольшой размер, легкий вес (может быть переносным), не требует сложного лабораторного оборудования, может быть выполнен тест образца непосредственно на месте, подходит для первичной медицинской помощи, полевого мониторинга, портового карантина и других сцен.

Интеллектуальность и автоматизация: снижение операционного порога

Интеллектуальность и автоматизация являются ключом к повышению удобства и стабильности обнаружения. Интеграция автоматизированных модулей обработки образцов (например, автоматическое извлечение нуклеиновой кислоты, автоматическое сложение образцов) позволяет автоматизировать весь процесс от предварительной обработки образцов до вывода результатов испытаний, уменьшая ошибки в работе человека и снижая профессиональные требования к операторам. В то же время, в сочетании с алгоритмами искусственного интеллекта, можно достичь автоматической оптимизации параметров обнаружения, интеллектуального анализа кривых флуоресценции, автоматического распознавания образцов аномалий, дальнейшего повышения точности и надежности обнаружения.

5. Интеграция с другими технологиями: расширение границ обнаружения

Слияние флуоресцентной количественной технологии PCR с другими молекулярными биологическими методами может еще больше расширить границы обнаружения. Например, интеграция с цифровой технологией PCR может обеспечить количественную оценку на одном молекулярном уровне, повысить чувствительность к обнаружению, подходит для обнаружения образцов нуклеиновых кислот с низким содержанием (например, ранняя диагностика опухолей, микрообнаружение патогенов); Интеграция с технологией секвенирования может обеспечить двойное обнаружение « количественного + качественного » не только для определения концентрации целевой нуклеиновой кислоты, но и для анализа информации о ее последовательности, применимой к отслеживанию патогенов, точному анализу мутаций генов и другим сценариям.

В качестве основного оборудования в области молекулярного тестирования флуоресцентный количественный детектор PCR, благодаря своим преимуществам точной количественной, высокой чувствительности и широкого применения, стал « точной шкалой» в области научных исследований и инноваций, клинической диагностики, безопасности пищевых продуктов и мониторинга окружающей среды. По мере того, как технология продолжает развиваться, флуоресцентные количественные детекторы PCR будут развиваться в направлении более быстрого, точного, удобного и высокого потока, чтобы еще больше расширить сценарии применения и обеспечить более мощную техническую поддержку для исследований в области наук о жизни и безопасности общественного здравоохранения. В будущем, будь то точные исследования в научно - исследовательских лабораториях или быстрая диагностика первичной медицины, мы не сможем обойтись без помощи этого « молекулярного детектирования», чтобы продвигать технологию молекулярного обнаружения, чтобы лучше служить здоровью человека и социальному развитию.